Q1：如果纯化产物用于文库构建，但是使用的是Nuclease-free H2O洗脱的，如何操作？

若条件允许，加入等体积2 ×Frag/Prime Buffer，之后反应体系均放大，直至做到纯化步骤，恢复体系，也可以再次使用VAHTS^® RNA Clean Beads (Vazyme #N412)进行纯化，最后用Frag/Prime Buffer洗脱。

Q2:纯化产物可以保存多久？

纯化产物可以在-20°C保存一天，在-80°C保存一个月。

Q3:如果文库浓度过低，可以从哪些角度去寻找原因并如何改进?

以高质量的RNA样品为模板构建得到的文库浓度都能达到上机测序要求，如果无法提供合格的RNA样品，可尝试使用以下方法弥补：

◇起始量：提高样品起始量，最大可做到5 μg；

◇做几个重复的样品，到二链合成纯化步骤合并在一起，或做到文库扩增前合并在一起；

◇做不分选方案：94°C 8 min打断条件下RNA片段虽然偏小，但是分布会很集中，均一性也较好，有些个性化样品会出现打断不均一、某些大小的片段较多，经过PCR更明显，出现刺峰，这种情况在不分选方案中出现很少。

Q4:本试剂盒是否适合用于small RNA文库制备？

不适用。因为small RNA的长度仅为22 nt左右，而磁珠抓取片段最低为100 bp以上，无法有效富集到small RNA片段。