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Q1:没有扩增产物:
A1:① 样品在收集过程中丢失: 重新收集样品,确定不会因操作不当,造成样品意外丢失。
② 基因组DNA样本中含有抑制反应的成分: 纯化或者稀释DNA样品。如果样品纯化过程中有乙醇沉淀或漂洗步骤,样品中残留的酒精会抑制反应,纯化过程中要让酒精充分挥发。
③反应温度过高: 反应温度应控制在30℃,过高的温度会使聚合酶失活,如果使用具有热盖功能的PCR仪 进行反应,请将热盖温度设为70℃。
Q2:扩增产生7.5 - 20 μg DNA,但检测到部分染色体错位或等位基因丢失:
A2:①对于以基因组DNA为起始模板的反应: 基因组DNA存在降解。应使用完整的DNA或使用更多量的DNA做为模板。
②对于以细胞作为起始的反应:细胞存在凋亡或者细胞被固定过导致DNA降解;细胞存在难以被裂解的细胞壁(如植物细胞)不适合直接作为起始材料。
Q3:阴性对照有一定的产出,但下游检测结果为阴性(如qPCR):
A3:无模板的阴性对照反应中,由引物的随机聚合延伸产生的高分子量DNA产物,这种产物不影响目的产物的质量及下游分析。
Q4:阴性对照扩增产生7.5 - 20 μg DNA,且下游检测结果为阳性(如qPCR):
A4:可能存在交叉污染,由于本反应对微量DNA非常敏感,替换掉所有可能被DNA污染的试剂及用品。