Q1、采用其他软件设计的茎环逆转录引物及定量引物，能否使用Vazyme #试剂盒（MR101+MQ101）？

A1：可以的。逆转录时可参照说明书直接投入其他软件设计的茎环逆转录引物（2μM浓度），且后续定量实验直接投入相应的定量上下游引物即可。注：若其他软件默认的茎环引物与Vazyme miRNA 引物软件默认的相同，后续搭配MQ101无需合成反向引物，可以使用MQ101自带的mQ Primer R；若茎环引物序列不同，则MQ101提供的mQ Primer R无需使用，需合成正反向引物。

Q2、内参是否需要设计茎环引物及如何逆转录和定量的引物如何使用？

A2：若选择U6等较长的基因作为内参基因，由于序列相对较长，无需设计茎环逆转录引物，直接使用常用的Primer Premier 5等软件设计即可，逆转录时投入内参下游引物（2μM浓度），且后续定量实验直接投入内参的上下游引物即可。如果选择长度较短的miRNA作为内参，需要设计茎环引物进行逆转录，推荐使用Vazyme miRNA 引物设计软件设计逆转录引物和qPCR引物。

Q3、如果要研究多个miRNA定量实验，是不是每个miRNA均要单独设计一条茎环引物进行逆转录？

A3：是的，针对每个miRNA都要设计一条茎环逆转录引物，一管反应中只能逆转一个miRNA（内参也是一样），即不同逆转录引物均需要分管逆转录。

Q4、在逆转录时，多个茎环逆转录引物/内参引物是否可以在同一管中进行？

A4：不推荐。在一管中同时投入多个茎环逆转录引物进行多个miRNA逆转录时，不同特异性茎环引物茎环结构之间会产生相互干扰和影响。

Q5、逆转录体系应该投入多少RNA？

A5：如果提取的是Total RNA，MR101可以兼容10 pg-1 μg的RNA投入量，但是不同miRNA表达丰度不同，建议尽量投入0.5-1 μg RNA。如果提取的是miRNA，逆转投入量参考1/10-1/5 total RNA的量加入，具体还是要根据目标miRNA的丰度来调整。

Q6、miRNA为什么要合成茎环引物？

A6：因为miRNA较短，如果使用普通逆转录和定量方法，无法设计定量引物，需要在逆转录阶段将cDNA延长。