Q1：1.5μl反应体系加入多少样本的体积？

A1：5μl的反应体系下，加入的样本体积最好不要超过0.5μl，如果样本体积较大，建议适当增大反应体系。

Q2：整个体系能否减半？

A2：可以，但是不建议，一步法体系较为复杂，大体系做效果更好。

Q3：真的可以适用于一个细胞的定量吗？检测的基因数量最多可以达到多少？会不会造成扩增偏好性？

A3：单细胞是可以的，亦可用于2-1000 cells或10 pg-100 ng RNA的样品；最多可混合500对不同基因的扩增引物；关于扩增偏好性，只要根据细胞数控制好循环数，不会造成偏好性。

Q4：样本不是分散开的细胞，而是一小块组织，可不可以用呢？组织是否可用裂解液进行裂解细胞？

A4：可以的，但是组织块不能太大，大约有几十个细胞量的组织块是可以的，但是超过这个范围，目前还没有案例。该产品反应体系只有5μl，不兼容细胞裂解液，大量的裂解液会影响反应的进行，可以将组织进行液氮速冻，直接投入到反应体系即可。

Q5：引物可以使用Oligo dT或随机引物吗？

A5：不可以，因为该产品是RNA提取纯化、逆转录和PCR反应在同一管内完成，如果使用Oligo dT或随机引物无法达到预扩增的目的。

Q6：引物设计有何要求。

A6：(1) 除了要符合常规的PCR引物设计要求外，还要注意区分外显子和内含子。

(2) 如果引物池存在2对以上的引物时，退火温度建议都是60℃左右。

Q7：逆转录时间设置为60 min，时间太长，是否可以缩短？退火、延伸这一步骤15 min，循环数20，可以把延伸时间和循环数调节一下？

A7：逆转录时间与扩增的基因数目也有关，最保险的是使其进行充分的逆转录，60 min可以保证充分逆转。延伸时间可以根据后期要测试的基因数量进行调节，这里设置的15 min，是为了彻底逆转500个基因，后续客户可根据细胞/RNA投入量进行调节；循环数20也是可以根据样本细胞量进行调节的。

Q8：PCR预扩增结束后的产物先稀释了5倍，然后再稀释10倍，为什么要这样做呢？为什么不一步稀释到位呢？低丰度，高丰度的基因都是稀释50倍吗？

A8：稀释5倍是作为储存液，再稀释10倍作为工作液。稀释的倍数是可以根据基因的表达量和样本量进行调整的，所以最好提前做个预实验判断一下。

Q9：配置好RT-PreAmp Master Mix后，冰上可以放置多长时间？

A9：放置时间越短越好，我们测试过冰上放置5 min左右没有问题。